皮革及其制品中含有抗菌剂，以期提高产品的防霉变性能，异噻唑啉酮类抗菌剂作为一类广谱、高效的抗菌剂，常用于皮革及其制品的防霉处理[1-4]。异噻唑啉酮类抗菌剂首先由美国Rohm&Haas公司取得专利权，开发出性能优良的成熟产品。作为一类非氧化型抗菌剂，异噻唑啉酮类抗菌剂对受体细胞膜和细胞壁具有很强的穿透能力，可穿透进入细胞内部，与含有巯基(-SH)的物质发生反应，生产S-S键，破坏细胞的再生繁殖，导致其死亡[5-6]。但是，大量研究结果表明，部分异噻唑啉酮类抗菌剂对人体和环境有害，对水生动物具有急性毒性[7-9]，长期接触时可引发接触性皮炎、湿疹、皮肤灼伤、哮喘[10-22]，职业性接触时甚至可引起中毒性肝病死亡[23]。有鉴于此，各国立法限制使用部分异噻唑啉酮类抗菌剂[24-25]。目前限制使用的异噻唑啉酮类抗菌剂共有7种：4，5-二氯-2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮(DCOI)、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MI)、2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮(OI)、2-丁基-1，2-苯并异噻唑啉-3-酮(BBIT)、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMI)、2-甲基-1，2-苯并异噻唑啉-3-酮(MBIT)、1，2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)。皮革及其制品中异噻唑啉酮类抗菌剂的测试已有文献报道[26-29]，但测试对象并未涵盖全部7种限用异噻唑啉酮类抗菌剂。串联质谱法采用多反应监测(MRM)模式进行定量，受基体干扰少，定量下限低[30-36]。本文采用超声萃取-固相萃取柱净化-气相色谱/串联质谱法技术，建立了1个气质联用分析方法，对皮革及其制品中7种异噻唑啉酮类抗菌剂进行了同时测定。
1 实验部分
用色谱纯甲醇(美国Fisher Scientific公司)将DCOI(纯度99.8%、日本东京化成株式会社)、MBIT (纯度98.0%，德国 GmbH公司)、MI(纯度99.5%、美国Sigma-Aldrich公司)、BBIT(纯度95.0%，德国 GmbH公司)、CMI (纯度99.0%，德国 GmbH公司)、OI(美国纯度99.9%，Sigma-Aldrich公司)、BIT(纯度99.2%，美国Sigma-Aldrich公司)配制为混合标准储备液，其中OI、BBIT、MBIT、BIT、CMI、DCOI、MI的质量浓度分别为19.19、20.49、20.75、38.40、39.20、39.67、40.23 g/mL。用甲醇将其逐级稀释，配制混合标准工作液。
阳性样品为市售黑色牛皮革，该样品中同时检出MI和CMI。将样品剪成小块，用Retch SM2000织物研磨仪(德国Retch公司)磨成粉末。称取1.0 g粉末样品，置于装有25 mL甲醇的35 mL玻璃反应瓶中，用MJ-600超声波清洗机(无锡市美极超声设备有限公司)超声萃取25 min，萃取温度为40 ℃。过滤，用鸡心瓶收集滤液。将鸡心瓶转移至RV10旋转蒸发仪(广州华馨科学仪器有限公司)中，在真空下旋转蒸发至近干。将鸡心瓶转移至DCY-12氮吹仪(常州市万合仪器制造有限公司)中，用干燥氮气缓慢吹干，残渣用2 mL甲醇溶解。用5 mL甲醇对Supelclean LC-Ph固相萃取柱(0.5 g/3 mL，美国supelco公司)进行预活化处理后，将所得溶液转移到萃取柱中，用5 mL甲醇淋洗，收集流出液。将流出液在RV10旋转蒸发仪中旋转蒸发至近干，在DCY-12氮吹仪中用干燥氮气缓慢吹干后，用1mL甲醇溶解残留物[37-39]，所得溶液用0.45 m滤膜(德国CNW Technologies公司)过滤后供GC/MS-MS分析用。
采用Shimazdu GCMS-TQ 8040MX气质联用仪(日本Shimazdu公司)进行测试。色谱分离在RXi-5MS(30 m0.25 mm0.25 m)色谱柱上进行，采用不分流进样方式，进样量为1L。程序升温方式，初温为90 ℃，以15 ℃/min的速度升至280 ℃，保持3 min。溶剂迟延为3min。进样口温度和传输线温度分别为270 ℃、280 ℃。载气为高纯氮气(纯度＞99.999%)，载气流速为1.1 mL/min。
质谱条件为：电子轰击(EI)电离方式，电离能为70 eV，离子源温度和四极杆温度分别为210 ℃和150 ℃，多反应监测(MRM)条件见表1。
2 结果与讨论
2.1 超声萃取条件的优化
影响超声萃取效率的主要因素有5个：萃取温度、萃取溶剂种类、萃取时间、萃取方式、萃取溶剂体积[36-37，40-44]。首先考察萃取温度(因素A)、萃取时间(因素B)和萃取溶剂体积(因素C)对萃取量的影响[41]。使用甲醇作为萃取溶剂对阳性样品进行单次超声萃取，只改变其中1个因素而另外2个因素维持不变，观察萃取量的变化规律，结果发现，萃取量随这3个因素变化而变化规律相同，当萃取温度(萃取时间、萃取溶剂体积)增加时，萃取量逐渐增加并达到最大值，继续增加时，萃取量反而有所下降。萃取量达到最大值时对应的萃取温度、萃取时间、萃取溶剂体积分别为40 ℃、30 min、25 mL。设计了表2所示的三因素三水平正交实验来考察这3个因素对萃取量的综合影响，在表2给出的每个实验条件下以甲醇为萃取溶剂对阳性样品进行单次超声萃取，测定其萃取量，结果见表3。该阳性样品中同时检出MI和CMI，对于MI和CMI，利用表3中的数据分别计算因素A、因素B和因素C的k值和极差，从而确定其优方案[45]。计算结果表明，对于MI和CMI，优方案均为A1B2C1。在此优方案给定的萃取条件下，以甲醇为萃取溶剂，对阳性样品进行连续3次超声萃取，测定每次的萃取量和总萃取量。对于MI，3次萃取量分别为1.95、0.04、0.00 mg/kg；对于CMI，3次萃取量分别为3.51、0.10、0.00 mg/kg。经1次萃取后，98.0%的MI和97.2%的CMI被萃取出来。可见，单次超声萃取可将待测样品中的目标分析物基本萃取完全。萃取溶剂种类是决定萃取效果主要的因素，由于皮革及其制品中含有大量的脂类物质，而脂类物质易溶于正己烷、丙酮、叔丁基甲醚、石油醚等弱极性溶剂，采用这些弱极性溶剂作为萃取溶剂时，会导致大量伴生杂质被萃取出来，严重干扰目标分析物的测试。为此选择水、乙醇、甲醇、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯等极性较强的溶剂作为萃取溶剂，对阳性样品进行单次超声萃取，MI和CMI的萃取量见表4。对于MI和CMI，甲醇的萃取效果均最好。因此，超声萃取条件最终优化如下：采用单次萃取方式，以甲醇为萃取溶剂，萃取温度为40 ℃，萃取时间为25 min，萃取溶剂体积为25 mL。
表1 MRM条件
表2 正交实验
2.2 净化条件的优化
固相萃取柱(SPE)净化技术基于液-固相色谱理论[46]，利用选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱法分离原理，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离和净化。固相萃取柱的净化效果主要取决于填料和容量，填料是色谱吸附剂，分为以硅胶为基质、以高聚物为基质、以无机材料为主三大类；吸附剂在吸附目标化合物时，也会吸附同类性质的杂质，容量过低时会导致回收率偏低。不同固相萃取柱对同一目标分析物的净化效果各不相同[28-31]。经固相萃取柱净化后，往往会损失部分目标分析物，也可能引入新的杂质。采用16种常见的固相萃取柱对混合标准储备液进行净化，测定各色谱峰面积，并与未经净化处理的色谱峰面积进行比较，计算净化后的回收率，结果见表5。从表5可知，经16种常用固相萃取柱净化处理后，7种目标分析物均有所损失，其中1#柱Supelclean LC-Ph柱(0.5 g/3mL)损失最少，回收率均大于95%。对经这16种固相萃取柱净化处理后的混合标准储备液的谱图进行比较，发现经1#柱处理后所得谱图基本无杂质峰出现，基线平稳。因此最终选择1#柱进行净化处理。
表3 正交实验数据分析
表4 不同溶剂的萃取效果/mg/kg
图1 混合标准溶液的GC/MS-MS总离子流图1：MI;2:CMI;3:BIT;4:MBIT;5:OI;6:BBIT;7:DCOI
2.3 分析条件的优化
混合物中各组分在色谱柱固定相和流动相之间分配系数各不相同，进行色谱分离时，各组分在固定相和流动相之间反复分配，从而使各组分获得分离。影响色谱柱分离效果的主要因素是固定相的组成和色谱柱长度。考察DB-5HT (30 m 0.25 mm 0.10 m)、RXi-5MS (30 m 0.25 mm 0.25 m)、DB-17MS (30 m 0.25 mm 0.25 m)、DB-Wax (30 m 0.25 mm 0.25 m)、DB-5MS (60 m 0.25 mm 0.25 m)、DB-5MS (30 m 0.25 mm 0.25 m)、DB-624(30 m 0.25 mm4.10 m)、DB-Wax(60 m 0.25 mm 0.25 m)等8种常见色谱柱对混合标准溶液的分离效果，结果发现，RXi-5MS色谱柱的分离效果最好。改变升温程序，观察各组分的分离情况，在最佳升温程序下，7种异噻唑啉酮类抗菌剂完全分离。
表5 经和未经固相萃取柱净化后的回收率备注：1#柱：Supelclean LC-Ph柱(0.5 g/3 mL)；2#柱：Supelclean LC-FlorisilSPE柱(1 g/6 mL)；3#柱：Agilent Bond Elut C18柱(1 g/6 mL)；4# 柱：Waters Sep-Pak Vac Silica柱(1 g/6 mL)；5#柱：Supelclean ENVI-18 SPE柱(0.5 g/3 mL)；6# 柱：CNW Bond LC-C18 SPE柱(1 g/6 mL)；7#柱：Agilent Bond Elut Al-N中性氧化铝柱(1 g/6 mL)；8#柱：Waters Sep-Pak Vac C18柱(0.5 g/3 mL)；9#柱：Anpelclean PA SPE柱(1 g/6 mL)；10#柱：Accu Bond Alumina柱(1 g/6 mL)；11柱#：Supelclean LC-SiSPE柱(3 g/6 mL)；12#柱：Varian HF Bond C18 SPE柱(2 g/12 mL)；13#柱：Agilent Bond Elut Si SPE柱(1 g/6 mL)；14# 柱：Varian Bond Elut SCX柱(0.5 g/3 mL)；15#柱：Supelclean LC-18 SPE柱(1 g/6 mL)；16#柱：Accu Bond FlorisilPR柱(0.5 g/3 mL)
对混合标准溶液进行全扫描质谱分析，得到总离子流图，确定7种异噻唑啉酮类抗菌剂的保留时间和一级碎片离子。对于每种异噻唑啉酮类抗菌剂，选择强度较高的2～3个一级碎片离子作为母离子，对其进行轰击，产生二级碎片离子，所用碰撞电压为15V。母离子与其产生的每个二级碎片离子可以组成一个子离子对。观察每个子离子对的强度，对于每个母离子，选择强度较大的2～3个子离子对用于MRM条件优化。采用分段扫描方式进行质谱分析，共设立3个时间段，分别为3.0～5.5 min、5.5～8.0 min、8.0～15.5 min。每个时间段内设立多个扫描通道，为了提高每个子离子对数据的采集质量，每个子离子对使用1个单独的扫描通道。碰撞电压从5V增加到50V，步长为5V，观察每个子离子对的强度在不同碰撞电压下的变化。对于每种异噻唑啉酮类抗菌剂，选择强度最大的2个子离子对用于定性定量分析，其中强度最大的子离子对用于定量分析，这2个子离子对的碰撞电压就是优化碰撞电压。表1给出了7种异噻唑啉酮类抗菌剂的MRM条件，在此条件下对混合标准溶液进行测试，得到其MRM总离子流图，如图1所示。图1中7种目标分析物谱峰完全分离，各谱峰峰形尖锐，对称性好。
表6 线性关系和定量下限(LOQ)
图2 1个阳性样品的GC/MS-MS图
2.4 线性关系和定量下限
按1.3给出的分析条件对系列浓度的混合标准工作液进行测试，获得混合标准工作液中各组分的峰面积(A)，用峰面积对质量浓度()作图，结果表明，在一定质量浓度()范围内，峰面积(A)与质量浓度()之间存在良好的线性关系，线性相关系数大于0.9992。表6给出了7种异噻唑啉酮类抗菌剂的线性关系。在10倍信噪比(S/N=10)的条件下确定方法的定量下限，OI、BBIT、MBIT的定量下限均为0.05 mg/kg、BIT、CMI、DCOI、MI的定量下限均为0.10 mg/kg。
2.5 回收率和精密度
采用空白样品加标回收的方法来确定方法的回收率和精密度[32]，所用空白样品分别为不含目标分析物的牛皮革、羊皮革和猪皮革，分别添加3个不同浓度水平的混合标准溶液，制备测试样，每个添加浓度水平各制备9个测试样。对各测试样进行测试，测定各组分的含量，计算各组分的加标平均回收率和相对标准偏差(RSD，n=9)。方法的精密度用相对标准偏差(RSD，n=9)来表述，结果见表7。7种异噻唑啉酮类抗菌剂的加标平均回收率为80.25%～95.86%，方法精密度为2.84%～12.75%。
表7 回收率和精密度实验
2.6 实际样品测试
对市售皮革及皮革制品样品中异噻唑啉酮类抗菌剂含量进行测试[28-29]，测试样品共32个，包括牛皮及牛皮制品样品17个、羊皮及羊皮制品样品8个、猪皮及猪皮制品样品7个，结果在1个样品中同时检出MI和CMI，其余31个样品中未检出异噻唑啉酮类抗菌剂。阳性样品为黑色牛皮革，图2是其GC/MS-MS图，该样品中同时检出MI和CMI，含量分别为1.95、3.51 mg/kg。
3 结论
建立了1个GC/MS-MS方法，对皮革及其制品中7种限用异噻唑啉酮类抗菌剂进行了同时测定。该方法利用超声萃取技术提取待测样品中的限用异噻唑啉酮类抗菌剂，提取物经固相萃取柱净化后进行GC/MS-MS分析，外标法定量。该方法定量下限低至0.05～0.10 mg/kg，远低于相关法规的限量要求，可完全满足皮革及其制品中限用异噻唑啉酮类抗菌剂含量的日常检测工作需要。采用该方法对市售皮革样品进行测试，结果在部分样品中检出异噻唑啉酮抗菌剂。
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文章来源：皮革与化工 网址: http://pgyhg.400nongye.com/lunwen/itemid-47236.shtml
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